ĐÁP ỨNG VỚI NHIỆT ĐỘ THẤP VÀ VAI TRÒ CỦA TÁC NHÂN ĐIỀU HÒA PHIÊN MÃ DREB1/CBF CỦA CÂY BẠCH ĐÀN

1. Bạch đàn là cây hạt kín hai lá mầm thuộc họ Myrtaceae. Giống bạch đàn gồm khoảng hơn 700 loài, phân bố ở tất cả các vùng khí hậu ở Australia, ngoại trừ rừng nhiệt đới ẩm. Cây bạch đàn có lá thường xanh, có thể ở dạng cây bụi hay cây gỗ lớn tùy thuộc vào loài. Lá bạch đàn rất giàu tinh dầu tích tụ trong các cấu trúc đặc biệt ở trên lá gọi là các thể dầu (Fahn, 1979). Nguồn tinh dầu của bạch đàn rất quý giá và ngày càng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và mĩ phẩm. Bạch đàn đã trở thành loài cây trồng rừng phổ biến nhất trên thế giới nhờ rất nhiều đặc tính của nó như sinh trưởng nhanh, sản lượng cao và thời gian khai thác ngắn, chất lượng gỗ tốt và đáp ứng được nhiều điều kiện về đất đai cũng như khí hậu (Kirch et al., 2011). Gỗ bạch đàn có giá trị kinh tế cao, phù hợp cho nhiều mục đích khác nhau, trong đó có công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học (Kole, 2007). Nên diện tích trồng rừng bạch đàn ngày càng tăng với tốc độ cao (Gonçalves et al., 2013). Tuy nhiên, việc trồng bạch đàn ở những vùng có nhiệt độ trung bình thấp cũng gặp một số trở ngại (Booth, 2013).

Ở các vùng lạnh, sự tồn tại của bạch đàn phụ thuộc nhiều vào băng giá vì các cơ quan khí sinh của nó bị phơi lạnh liên tục do là loài cây có lá thường xanh và không có ngủ đông (Booth, 2013). Trong điều kiện stress nhiệt độ thấp, có khả năng loài cây này sử dụng các chiến lược thích nghi đặc biệt khi so sánh với ở cây thân cỏ hàng năm hay cây lâu năm lá rụng. Các nghiên cứu về tính chống chịu của cây bạch đàn ở điều kiện nhiệt độ thấp có thể xác định được các cơ chế thích nghi mới ở loài cây này. Hơn nữa, có thể giúp mở rộng vùng trồng bạch đàn trên một diện tích rộng lớn ở những nơi có khí hậu thấp, giúp tận dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đất, giảm cạnh tranh đất nông nghiệp. Như vậy, việc xác định được cơ chế đáp ứng với nhiệt độ thấp của cây bạch đàn là một đòi hỏi vô cùng cấp thiết.

Trong khi đó, các gen DREB1/CBF (C-repeat Binding Factor) được biết đến với vai trò chìa khóa trong sự điều hòa các trả lời thích nghi với lạnh của nhiều loài thực vật thông qua nhiều nghiên cứu về biểu hiện gen cũng như chuyển gen. Tuy nhiên, những hiểu biết về chức năng của các gen DREB1/CBF ở các cây thân gỗ còn cực kì hạn chế. Việc trả lời câu hỏi liên quan tới vai trò của gen DREB1/CBF ở cây bạch đàn là yêu cầu đặc biệt của công tác chọn tạo giống cây trồng.

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài nghiên cứu «Đáp ứng với nhiệt độ thấp và vai trò của tác nhân điều hòa phiên mã DREB1/CBF của cây bạch đàn». Với cách tiếp cận ở mức độ phân tử, kết quả thu được của đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn, góp phần làm sáng tỏ cơ chế thích nghi với nhiệt độ thấp của cây bạch đàn ở mức độ phân tử. Đồng thời, làm sáng tỏ vai trò của tác nhân điều hòa phiên mã DREB1/CBF ở cây bạch đàn. Từ đó có thể tạo ra được các giống cây bạch đàn có khả năng thích nghi với các vùng có nhiệt độ thấp, góp phần mở rộng diện tích trồng bạch đàn, giải quyết được nhu cầu cho các ngành công nghiệp liên quan.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu nghiên cứu (nguồn gốc và các điều kiện trồng cấy)

Lá của các cây bạch đàn non trồng trong các điều kiện có kiểm soát của hai loài Eucalyptus grandis và E. gunnii được thu để nghiên cứu sự biểu hiện gen. Song song với việc đó là các cây non ex vitro của bạch đàn lai E. urophylla  x E. grandis đã được sử dụng để đánh giá kiểu hình và nghiên cứu sự biểu hiện gen.

Trong nghiên cứu này, cây bạch đàn Eucalyptus gunnii được đặt trong điều kiện trồng trong phòng lạnh nhân tạo theo một chương trình được thiết kế trong nhóm nghiên cứu (Keller et al., 2013) trong khi cây E. grandis được đặt trong điều kiện sốc nhiệt 8 giờ ở 4°C.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Sản xuất các vật liệu nghiên cứu ex vitro

Nhằm thu được các cây chuyển gen ex vitro, một protocol bao gồm ba giai đoạn đã được thiết lập sau rất nhiều các thử nghiệm bằng cách biến đổi môi trường MS tương ứng với những thay đổi về pH và của thành phần các loại vitamin và/hoặc đường saccarose và/hoặc các tác nhân điều hòa sinh trưởng (phytohormone).

2.2.2. Đánh giá kiểu hình của các cây chuyển gen

Ước lượng khả năng chịu dựng các stress nhiệt độ thấp bằng phương pháp đo dòng các ion (Dexter et al., 1930; Travert et al., 1997) và đo huỳnh quang diệp lục của các lá

Phân tích giải phẫu nhờ kính hiển vi điện tử quét (Hitachi, Ibraki, Japon).

Xác định nồng độ các diệp lục theo Lichtenthaler (Lichtenthaler, 1987) và ước lượng tốc độ tách chiết diệp lục theo phương pháp của  Lolle (Lolle et al., 1997).

2.2.3. Phân tích biểu hiện gen

ARN tổng số được tách chiết từ 100 mg lá tươi đã nghiền trong nitơ lỏng bằng cách sử dụng bộ kit ‘SV Total RNA Isolation System’ của hãng Promega có biến đổi (Jones et al., 1985). Sau đó phân tích biểu hiện gen nhờ PCR theo thời gian thực (RT-qPCR) được thực hiện với máy ABI Prism 7900HT (Foster City, CA, USA).

2.2.4. Phân tích thống kê

Test Tukey HSD đã được sử dụng để so sánh nhiều giá trị trung bình được tính từ các mẫu nhắc lại sinh học hay kĩ thuật của các dòng cây nghiên cứu khác nhau.

2.2.5. Phân tích in silico

Các trình tự hệ gen, phiên mã hay protein suy diễn của hệ gen bạch đàn E. grandis có ở trang web Phytozome. Các gen DREB1/CBF được xác định nhờ phương pháp in silico.